Comment utiliser un spectrophotomètre ?

Quelles sont les étapes d’utilisation d’un spectrophotomètre ?
Pourquoi utiliser un spectrophotomètre ?
Quels sont les cas d’utilisation d’un spectrophotomètre ?

L’utilisation d’un spectrophotomètre est courant dans des laboratoires scientifiques, notamment en chimie, biologie et en analyse environnementale. Son fonctionnement repose sur la spectrophotométrie, une méthode d’analyse qui mesure la capacité d’une substance à absorber la lumière à longueur d’onde donnée. Ce processus commence par la projection d’un faisceau lumineux à travers une solution contenue dans une cuvette. Grâce à cette mesure, il est possible de déterminer des concentrations d’espèces chimiques, d’étudier la cinétique de réactions ou encore de vérifier la pureté de certaines substances. L’utilisation d’un spectrophotomètre repose sur des principes physiques fondamentaux tels que la loi de Beer-Lambert qui relie l’absorbance à la concentration.

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Quelles sont les étapes d’utilisation d’un spectrophotomètre ?

L’utilisation d’un spectrophotomètre nécessite une préparation minutieuse, incluant le réglage de l’appareil et la manipulation correcte des cuves et solutions.

Préparation des cuves et des solutions

Cuve de blanc : avant toute mesure, il est nécessaire de préparer une cuve contenant uniquement le solvant de la solution à analyser. Cette cuve de blanc est utilisée pour corriger les effets d’absorption dus au solvant et aux parois de la cuvette. La mesure de cette cuve sert de référence.
Cuve de l’échantillon : il faut préparer ensuite une cuve identique contenant la solution à analyser. Il est essentiel de veiller à ce que les cuves soient propres et de ne pas toucher les faces transparentes pour éviter les traces de doigts, qui pourraient perturber les mesures par diffusion ou réflexion de la lumière.

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Réglage de la longueur d’onde

Sélection de la longueur d’onde : le spectrophotomètre doit être réglé à une longueur d'onde appropriée, souvent celle correspondant au maximum d’absorption de l’espèce chimique étudiée (λmax). Par exemple, pour un colorant bleu comme le bleu patenté, λmax est d’environ 640 nm. Ce choix maximise la précision de la mesure en obtenant une absorption élevée.
Calibration : pour ce faire, il faut insérer la cuve de blanc dans le compartiment du spectrophotomètre et effectuer la calibration pour "mettre à zéro" l’appareil. Cette étape permet de soustraire l’absorption du solvant et de la cuve.

Mesure de l'absorbance

Pour la mesure de l’échantillon, l’étape principale est de remplacer la cuve de blanc par celle contenant la solution à analyser. Il faut ensuite lancer la mesure en appuyant sur le bouton dédié du spectrophotomètre de laboratoire. L’absorbance à la longueur d’onde sélectionnée est calculée et affichée par l’appareil.

Une fois l’analyse lancée, le spectre d’absorption est enregistré. Si une analyse plus complète est nécessaire, il est possible d'enregistrer un spectre d'absorption en balayant différentes longueurs d'onde dans une plage définie (par exemple, de 400 à 700 nm pour des solutions colorées). Le spectre obtenu montre comment l'absorbance varie en fonction de la longueur d’onde.

Courbe d’étalonnage pour une concentration inconnue

Si l’objectif est de déterminer la concentration d'une solution inconnue, une courbe d’étalonnage est réalisée en préparant plusieurs solutions de concentrations connues. On mesure l’absorbance de chaque solution à λmax et on trace un graphique représentant l’absorbance en fonction de la concentration. La concentration de la solution inconnue peut alors être déterminée par interpolation sur la courbe d’étalonnage.

Pourquoi utiliser un spectrophotomètre ?

Un spectrophotomètre, qu’il soit de type UV-visible, visible, UV ou infrarouge, offre de nombreux avantages pour les mesures analytiques dans les laboratoires :

Quantification précise : la spectrophotométrie permet de mesurer avec précision la concentration d’une espèce chimique dans une solution, même à de très faibles concentrations. Grâce à la loi de Beer-Lambert, cette technique est fiable, à condition que la concentration ne dépasse pas la limite de validité de la loi (en général, inférieur à 10⁻² mol/L).
Étude des réactions chimiques : le spectrophotomètre est utilisé pour suivre la cinétique des réactions chimiques. En mesurant l'absorbance à différents moments, il est possible de suivre l’évolution de la concentration d’une espèce réactive au cours du temps.
Contrôle de la pureté des substances : en déterminant le spectre d'absorption d’une solution, il est possible de vérifier si des impuretés ou des contaminants sont présents. Cette particularité fait du spectrophotomètre un outil essentiel dans l'industrie pharmaceutique et chimique.
Mesure de la qualité optique : dans certains cas, comme pour les matériaux optiques ou les échantillons biologiques, il est nécessaire de mesurer la transmission ou l’absorption de la lumière à différentes longueurs d’onde. Cette mesure permet d’évaluer des propriétés telles que la transparence ou l’opacité.

Quels sont les cas d’utilisation d’un spectrophotomètre ?

Les applications d’un spectrophotomètre touchent de nombreux secteurs scientifiques et industriels :

Chimie analytique : en laboratoire, les spectrophotomètres sont utilisés pour doser des ions métalliques, des molécules organiques ou des complexes. Par exemple, ils sont employés pour déterminer la concentration de métaux lourds dans l’eau ou des additifs dans des solutions industrielles.
Biologie moléculaire : en biologie, les spectrophotomètres permettent de quantifier des biomolécules comme les acides nucléiques (ADN, ARN) et les protéines. Ils sont utilisés pour mesurer la croissance bactérienne en suivant l’absorbance à 600 nm.
Industrie pharmaceutique : l’utilisation d’un spectrophotomètre permet de vérifier la concentration en principes actifs dans les médicaments et assure la qualité des produits finis. Ils sont aussi utilisés pour des tests de dissolution, où l’absorbance permet de suivre la vitesse à laquelle un médicament se dissout dans un liquide.
Environnement : dans le cadre des analyses environnementales, les spectrophotomètres sont utilisés pour mesurer la concentration de polluants dans l’air, l’eau ou les sols. Par exemple, ils permettent de détecter des nitrates, phosphates ou des métaux toxiques dans les eaux usées.