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Par définition, l'électrophorèse est une technique de séparation et d'analyse des molécules chargées en fonction de leur taille, de leur charge et de leur mobilité électrophorétique. Étant une véritable pierre angulaire de la recherche scientifique, elle est fréquemment utilisée dans les laboratoires de biologie moléculaire, de biochimie ou de biotechnologie.
Cette technique trouve sa place dans le domaine de l’agroalimentaire, de la médecine, de l’industrie pharmaceutique et dans la protection de l’environnement. Pour réaliser cette technique, un appareil d'électrophorèse est essentiel dans les laboratoires et facilite la séparation des molécules.
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Quel est le principe de l’électrophorèse ?
Le principe de l’électrophorèse repose sur la migration de particules chargées dans un champ électrique. Elle est réalisée en utilisant un support poreux, généralement un gel d'agarose ou de polyacrylamide, dans lequel les molécules à séparer sont déposées. Sous l'influence d'un champ électrique, ces molécules se déplacent à travers le gel, se séparant selon leur charge et leur taille.
Le support poreux du gel crée des obstacles pour les molécules, permettant ainsi la séparation en fonction de la taille. En effet, les molécules plus petites et/ou plus chargées ont tendance à se déplacer plus rapidement à travers la matrice. Ce n’est pas le cas des molécules plus grandes et/ou moins chargées. En fin de course, des bandes distinctes de molécules séparées peuvent être observées dans le support poreux initial.
Quels sont les différents types d'électrophorèses existants ?
Les techniques traditionnelles
L'électrophorèse existe sous plusieurs formes en fonction du type de molécules à séparer. De base, il existe deux techniques traditionnelles qui sont :
- L’électrophorèse des acides nucléiques
- L’électrophorèse des protéines.
Les techniques avancées
L'électrophorèse avancée comporte :
- L’électrophorèse capillaire ou CE (Capillary Electrophoresis)
- L’électrophorèse bidimensionnelle
- Le DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
- Le TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis).
Comment fonctionne l'électrophorèse capillaire ?
Le principe de l’électrophorèse capillaire consiste à utiliser un flacon sous forme de tube capillaire en verre ou en polymère, d'environ 50 à 100 micromètres de diamètre et de plusieurs dizaines de centimètres de longueur. Le tube est rempli d'un électrolyte tamponné qui servira de milieu de séparation pour les molécules.
Les étapes de séparation des molécules
Les molécules chargées sont injectées dans le capillaire à l'aide d'une électrovanne ou d'une injection hydrodynamique. Une différence de potentiel est ensuite établie entre les deux extrémités du capillaire pour créer un champ électrique. Une électrode négative (cathode) est placée à l'extrémité d'injection et une électrode positive (anode) à l'extrémité opposée du capillaire.
Sous l'influence du champ électrique, les molécules se séparent en bandes distinctes à travers le capillaire, formant ainsi un profil de séparation basé sur leur taille et leur charge. La vitesse de migration est proportionnelle à la mobilité électrophorétique des molécules.
À mesure que les molécules traversent le capillaire, elles passent par un point de détection où leur présence est mesurée. Selon la nature des molécules, cette détection peut se faire par divers moyens, tels que :
- La fluorescence
- La spectrophotométrie UV
- La conductimétrie.
Les Conditions d’analyse des résultats
Les données de détection sont collectées et pour générer un chromatogramme ou un électrophérogramme. Ce dernier représente graphiquement la séparation des molécules en fonction de leur temps de migration. Les pics dans le chromatogramme correspondent aux différentes molécules présentes dans l'échantillon.
Comment fonctionne l'électrophorèse bidimensionnelle ?
Il existe deux principes d'électrophorèse bidimensionnelle (ou 2D-électrophorèse) bien distinctifs :
- L'électrophorèse en gel selon les propriétés de charge (isoélectrofocalisation, IEF)
- L'électrophorèse en gel selon les propriétés de taille (SDS-PAGE).
L’isoélectrofocalisation (IEF)
L'échantillon de est mélangé avec un tampon contenant des substances dénaturantes pour déployer les protéines en une forme linéaire et uniforme. Un gel avec un gradient de pH est préparé dans un tube capillaire ou sur une plaque bidimensionnelle.
L'échantillon est déposé à un bout du gel IEF. Ensuite, un champ électrique est appliqué, provoquant la migration des protéines vers leur point isoélectrique (pI) spécifique dans le gel en fonction de leur pH. Chaque protéine se fixe à l'endroit où le pH du gel est égal à son pI, où elle n'a pas de charge nette.
L’électrophorèse en gel selon la taille (SDS-PAGE)
Un gel de polyacrylamide est préparé dans une deuxième dimension, cette fois-ci avec un gradient de concentration d'un détergent, le dodécylsulfate de sodium (SDS). Ce dernier dénature les protéines et leur confère une charge négative.
Le gel IEF est placé sur le dessus du gel SDS-PAGE. Un champ électrique est à nouveau appliqué, mais cette fois-ci dans une direction perpendiculaire à celle de la première dimension. Les protéines se déplacent dans le gel SDS-PAGE en fonction de leur poids moléculaire. Les protéines se séparent en bandes verticales en fonction de leur poids moléculaire.
Le gel bidimensionnel résultant présente des taches où chaque protéine est localisée en fonction de son pI et de son poids moléculaire. Les protéines peuvent ainsi être identifiées, quantifiées et analysées à l'aide de détecteur tel que la spectrométrie de masse.
Quels sont les avantages l'électrophorèse ?
- L'électrophorèse permet une séparation efficace des molécules biologiques en fonction de leur taille et de leur charge. C’essentiel pour l'analyse et la caractérisation de divers types de biomolécules.
- L'électrophorèse peut être adaptée pour séparer différents types de molécules, notamment les acides nucléiques (ADN et ARN), les protéines et d'autres macromolécules biologiques.
- Les résultats de l'électrophorèse peuvent être obtenus assez rapidement, ce qui permet un flux de travail efficace en laboratoire.
En ce qui concerne l'électrophorèse capillaire, elle offre des avantages significatifs, tels qu'une résolution accrue, une rapidité d'analyse, une faible consommation de réactifs et une automatisation élevée. Son potentiel d'applications est vaste et continue d'évoluer grâce à des développements technologiques constants.
L'électrophorèse bidimensionnelle, quant à elle, permet d'obtenir un profil complexe de séparation des protéines. Il s’agit ainsi d’un outil puissant pour l'étude des protéomes et l'identification de protéines spécifiques dans des échantillons biologiques complexes.
Le prix d'un électrophorèse capillaire varie en fonction des spécifications de l'appareil et des besoins du laboratoire.
